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●マクロファージ活性化能試験

【貪食活性試験】

貪食機能を指標として、依頼サンプルのマクロファージ活性化能を評価します。

ラテックスビーズを貪食したJ774.1細胞(マウス単球細胞株)

図1

J774.1細胞にラテックスビーズを貪食させた後、洗浄し、ギムザ染色した。 矢印:ビーズ

<方法>

[1] in vitro 試験
マクロファージ細胞株(RAW246.7、NR8383、J774.1等)培養液中に依頼サンプルを添加し、回収した細胞に蛍光ラテックスビーズまたはザイモザンなどを貪食させて、貪食したマクロファージ の割合、貪食した粒子数を計測します。

[2] in vivo 試験
依頼サンプルをマウスに経口、腹腔内又は静脈内投与し、腹腔細胞等を回収し、接着法で回収した細胞(マクロファージ)を用いて蛍光ラテックスビーズまたはザイモザンなどを貪食させて、貪食したマクロファージの割合、貪食した粒子数を計測します。

【NO産生試験】

NO産生能を指標として、依頼サンプルのマクロファージ活性化能を評価します。

ラット末梢血単球(PBM)と肺胞マクロファージ細胞株(NR8383)のNO産生能の比較
図2
ラット末梢血から単球を回収し、大腸菌由来のLPSを各濃度(0.01〜100ng/ml)添加し、24時間後の培養上清を回収した。
グリエス試薬を用いて、上清中の亜硝酸量を測定した。

<方法>

[1] マクロファージ細胞株(RAW246.7、NR8383、J774.1等)培養液中に依頼サンプルを添加し、24〜72時間後の培養上清を回収します。NO産生能として、上清中の亜硝酸量をグリエス試薬を用いて測定します。

[2] 依頼サンプルをTLR4欠損マウス(C3H/HeJ)の腹腔マクロファージを用いて測定します。

[3] 依頼サンプルをポリミキシンBと混合し、NO産生能を測定します。

【TNF産生試験】

TNF産生能を指標として、依頼サンプルのマクロファージ活性化能を評価します。

肺胞マクロファージ細胞株(NR8383)のTNF産生能
図3
NR8383細胞に大腸菌由来のLPSを各濃度(0.1〜1000ng/ml)添加し、3時間後の培養上清を回収した。L-929細胞傷害試験(アクチノマイシンD存在下)試験でTNF産生量を測定した。

<方法>

[1]  in vitro試験:
マクロファージ細胞株(RAW246.7、NR8383、J774.1等)培養液中に依頼サンプルを添加し、3〜24時間後の上清を回収します。上清中のTNF量はELISAによる測定の他、L-929細胞傷害試験も対応できます。

[2] in vivo試験:
依頼サンプルをマウスに皮内、腹腔または静脈内投与し、血液(腹腔内投与の場合は腹腔洗浄液)を回収し、血清中や腹腔洗浄液中のTNF活性を測定します。

【in vivoでのTNF産生プライミング作用解析】

マクロファージの高感度活性化法として、TNF産生におけるプライミング作用を解析しています。この方法はin vivoでの各種免疫賦活物質の効果を明確にできる検出力を有しています。

TNFプライミング作用

図4

マウスに糖脂質を1ng静脈内に投与し、1.5、3、24時間後にOK-432(ピシバニール:溶連菌製剤)を1KE(0.1mg)投与した。2時間後に採血し、血清中のTNF活性をL929細胞傷害活性(アクチノマイシンD存在下)で測定した。
OK-432単独では1unit/mlのTNF活性であったが、糖脂質1ngの投与で、100unit/mlにTNF産生能が増強した。
この増強効果をプライミング作用と呼ぶ。

<方法>

依頼サンプルをマウスに経口、腹腔内又は静脈内投与し、3〜6時間後にLPSなどを静脈内投与し、1時間後の血中のTNF量を測定します。

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